پایان نامه با کلید واژه های باكتري، تشخيص، سالمونلاها، تيفي

phi) آزمون سيمون سيترات…………………………………………………………..104
شكل 4-4- سالمونلا تيفي تست TSI…………………………………………………………………………………………105
شكل5-4- سالمونلا تيفي را در محيط SIM………………………………………………………………………………..106
شكل6-4- سالمونلا تيفي را در تست متيل رد……………………………………………………………………………….106
شكل 7-4- باند DNA از سالمونلا تيفي از سس مايونز…………………………………………………………………107
شكل 10-4- باند ژن invA بدست آمده از سالمونلا تيفي استخراج شده…………………………………………..108
شكل11-4- باند نردباني محصول LAMP……………………………………………………………………………………110
شكل12-4- كدورت محصول LAMP…………………………………………………………………………………………111
شكل13-4- نمونه مثبت و منفي بعد از افزودن سايبرگرين…………………………………………………………………111

چكيده
سالمونلا باكتري گرم منفي، متحرك و باسيلي شكل است كه خصوصيات عمومي خانواده انتروباكترياسه را دارا مي‌باشد. سالمونلا و سروتيپ‌هاي آن منبع مهم آلودگي غذاهاي انساني و عامل پاتوژن بسيار قوي و بيماريزا در انسانهاست. امروزه بيش از 2450 سروتيپ سالمونلا شناسايي شده است كه برخي از اين سروتيپ‌ها عامل بيماري‌هايي از قبيل تب تيفوئيد و انتروكوليك در انسان مي‌باشند. بيماريهاي ناشي از اين عامل يک معضل بزرگ بهداشتي در جهان به خصوص در کشورهاي در حال توسعه از جمله کشور ما مي باشد. بنابراين تشخيص سريع، دقيق و به موقع آن براي جلوگيري از اپيدمي و عوارض مخرب اين باکتري ضروري بهنظر ميرسد.
روشهاي مختلفي براي جداسازي باكتري سالمونلا از نمونه‌هاي محيطي وجود دارد كه شامل: روش‌هاي كشت سنتي و بيوشيميايي، سرولوژيكي و مولكولي (از جمله PCR) است. تمام اين روشها به زمان طولاني، تعداد زياد باکتري در نمونه اوليه، تجهيزات گرانقيمت آزمايشگاهي و به افراد متخصص در اين زمينه نياز دارند.
هدف از اين مطالعه بررسي کارايي روش نوين تشخيص مولکولي LAMP در تشخيص عامل عفوني سالمونلا تيفي ميباشد. بررسي نتايج در تشخيص مولکولي سالمونلاها نشان داد که روش LAMP روشي سريع، ارزان و اختصاصي است و بهجاي دستگاههاي گرانقيمت PCR و برنامه چرخه حرارتي چند دمايي آن با استفاده از يک بلوك حرارتي بسيار ساده و ارزان و در يک دماي واحد 60 درجه سانتيگراد و همچنين مشاهده کدورت حاصل از فرايند تکثير ژنها در زمان كوتاهتري به تشخيص اختصاصي اين باكتري سالمونلا پرداخت.
اين روش مي تواند جهت تشخيص مولکولي سريع، دقيق و ارزان با كاربرد گسترده در آزمايشگاههاي تشخيصي و بخصوص تشخيص عوامل عفوني در آزمايشگاههاي مناطق محروم و آزمايشگاههاي سيار مورد استفاده قرار گيرد.
واژه هاي کليدي : سالمونلا، تشخيص مولکولي، PCR، LAMP

فصل اول

مقدّمه (اهداف تحقيق)

مقدمه
اعضاي جنس سالمونلا، باكتري گرم منفي، ميلهايي، بيهوازي اختياري و بدون اسپور هستند. از آنجا كه جايگاه اصلي و طبيعي اين باكتري‌ها روده انسان و حيوانات مي‌باشد اصطلاحاً آنها را باسيل‌هاي روده‌اي يا انتريك مي‌نامند. از لحاظ شرايط رشد اين ميكروارگانيسم‌ها باكتري‌هاي انعطاف‌پذيري بوده و به آساني با شرايط محيطي خود را هماهنگ مي‌كنند اين جنس از ميكروارگانيسم‌ها به حرارت حساس‌اند. در درجه حرارت‌هاي پائين امكان بقاي آنها بيشتر است .(Connie & Manuselis, 2000)
اكثر سروتيپ‌هاي سالمونلا پاتوژن‌هاي بالقوه براي انسان و بسياري از حيوانات مي‌باشند. اين باكتري‌ها در دستگاه گوارش مهره‌داران اعم از پستانداران و پرندگان و خزندگان و ماهي‌ها سيطره پيدا كرده، بسته به سروتيپ، شرايط و عوامل متعدد ميزباني، بيماريهايي با نشانه‌هاي گوناگون و عوارض متفاوت ايجاد مي‌كنند .(Merchant & Pocker, 1983)از جمله باكتريهاي رودهايي هستند كه موجب بيماري تب تيفوئيد(حصبه)، تب شبه حصبه و بيماريهاي ناشي از مواد غذائي در انسان ميگردند(Jay et al., 2005).
بيماريهاي ناشي از آلودگي مواد غذائي ناشي از سالمونلا را non typhoidal ناميدهاند. سالمونلا بهطور گستردهايي در محيط زيست از قبيل آب، خاك و مدفوع حيوانات توزيع شده است (Cidrp, 2009). باكتري معمولاً از طريق مدفوع انسان و يا دام دفع شده و باعث آلودگي آب و غذا و محيط مي‌گردد. مواد غذائي مانند گوشت، تخممرغ، مرغ، سس مايونز، سبزيجات و غيره ،از ناقلهاي اوليه عفونت سالمونلا به انسان هستند(Dolye & Beuchat, 2007)..
سالمونلاي غيرتيفوئيدي علت اصلي بيماريهاي ناشي از مواد غذائي در سراسر جهان است. كه برآورد شده كه حدود 4/1 ميليون مورد در سال مورد عفونت غذائي سالمونلا قرار ميگيرند(Mead et al., 1999).
از اينرو شناخت و تشخيص به موقع سالمونلا از اهميت خاصي برخوردار است. با ذكر تمامي اين موارد به نظر مي‌رسد تشخيص به موقع و كنترل باكتري از وظايف مهم آزمايشگاه‌هاي ميكروب‌شناسي است. امروزه از 3 روش رايج به تشخيص باكتري مي‌پردازند:
ـ روش‌هاي كشت سنتي و آزمايشات بيوشيميايي.
ـ روش‌هاي سرولوژيكي.
ـ روش‌هاي مولكولي.
براي تشخيص استفاده از روشهاي سنتي مبتني بر محيط كشت قابل قبول است ولي وقتگير است و براي تاييد جواب نهايي چند روز بهطول ميانجامد .(Andrews & Hammack, 2007) علاوهبر اين، روشهاي ايمنولوژيك مانند الايزا وIMS نيز براي شناسائي سالمون
لا توسه يافتهاند.
. (Mansfield & Forsythe, 2000 ; FAVRIN , 2001) با اينحال اختصايت كم و هزينههاي بالا، استفاده ازين روشها را محدود كرده است. اخيرا روشهاي مولكولي مانند PCR و real time PCR بهطور گسترده در شناسائي سالمونلا استفاده ميشوند كه روشهايي كارآمد و حساس هستند.
Krascsenicsova et al., 2008) ; Eriksson & Aspan, 2007).
با اينحال اين روشها نيازمند سيكل حرارتي اختصاصي و دستگاههاي گرانقيمتاند. ازاينرو نياز به يك روش دقيق، حساس، آسان و بهصرفهتر است. در سال 200 يك گروه ژاپني يك روش تشخيص مولكولي به نام LAMP را معرفي كردند .(Notomi et al., 2000)از آن زمان روش LAMP به عنوان يك روش اختصاصي، حساس و سريع براي شناسائي پاتوژنهاي ناشي از مواد غذائي مورد استفاده است. يك روش ساده، بدون نياز به سيكل حرارتي اختصاصي و دستگاههاي گرانقيمت و به آساني قابل اجرا است(Hara-Kudo et al., 2005; Notomi et al., 2000).
هدف اين تحقيق شناسائي باكتري سالمونلا تيفي در سالاد سبزيجات و سس مايونز آلوده با استفاده از روش LAMP، بهعنوان روشي سريع، حساس و اختصاصي ميباشد.
اهداف تحقيق در نگاه اجمالي
1. طراحي و بهينهسازي روش LAMP بر اساس ژن تهاجمي invA سالمونلا تيفي
2. تعيين حد حساسيت روش PCR و LAMP به روي ژن تهاجمي invA سالمونلا تيفي
3. مقايسه دو روش PCR و LAMP

فصل دوم

مروري بر تحقيقات انجام شده

1-2- مشخصات جنس سالمونلا
1-1-2- تاريخچه
در سال 1885 يك دامپزشك آمريكائي به نام دانيل المر سالمون براي اولين بار اين باكتري را از خوك جدا كرد وآن را باسيلوس كلراسوئيس1 ناميد. در سال 1888 جرم ديگري توسط گارتنر از فردي كه در اثر گاستروانتريت ناشي از مصرف گوشت نپخته مرده بود جدا شد و آنرا باسيلوس انتريتيديس ناميد كه بعداً سالمونلا انتريتيديس خوانده شد. در سال 1900 خواص اين باكتري توسط فردي به نام لينير بهطور رسمي تصويب گرديد. از آنجا كه اين ارگانيسم ها شبيه به باكتري هاي جدا شده توسط سالمون بودند، به همين جهت به افتخار كاشف اوليه اين باكتري سالمونلا2 ناميدند(Roumagnac et al., 2006).
در فاصله بين سالهاي 1925ـ1900 بزرگترين رويداد در كشف سرولوژيكي آنتي‌ژن‌هاي سوماتيك و فلاژلا در مورد گروه سالمونلا بوسيله ليگنيرز انجام شد. در سال 1926 تركيبات پادگني سالمونلا طبقه‌بندي گرديد و جدولي به نام جدول كافمن ـ وايت ايجاد شد. در حال حاضر اين جدول داراي حدود 2500 سروتيپ است (Bhatia & Nabb , 1980) .
سالمونلا بطور گسترده در طبيعت توزيع شده است مانند آب آلوده، خاك حاوي مدفوع حيوانات و غيره. به طور عمده اين باكتريها در رودهي حيوانات ساكن است و مخزن اصلي آلودگي مرغ، تخم مرغ، دام، حيوانات خانگي و خزندگان است(Cidrp, 2009).

2-1-2- خواص شكلي
اعضاي جنس سالمونلا باكتريهاي ميلهاي شكل و اندازهي آن 5-2 ?5/1-7 /. ميكرون بوده است.گرم منفي، بدون اسپور و متعلق به خانوادهي انتروباكترياسهاند (J. Antonio , 2009 ; Dolye & Beuchat, 2007) .. اكثر اعضاي اين جنس متحرك و با تاژهي پريتريشاند بهجز چند مورد استثناء مانند سالمونلا گاليناروم3 و سالمونلا پولوروم4 (et al., 2005 Hara-Kudo).

3-1-2- خواص بيوشيميايي
اعضاي اين جنس قادر به تخمير گلوكز بوده ولي از تخمير ساكارز و لاكتوز ناتوانند. بيشتر انواع سالمونلا ها گلوكز، مالتوز، مانيتول، دولسيتول، دكسترين و سوربيتول را تخمير مي كنند و اسيد و گاز بوجود مي آورند. اكثر سويهها H2sرا از منبع سولفوري معدني توليد كرده و توليد H2S يکي از واکنش هاي کليدي در تشخيص سالمونلاها ميباشد. به استثناي سروتيپ تيفي5 در بيشتر موارد جدا شده از گلوکز گاز ايجاد ميکنند. در سيترات به عنوان تنها منبع كربن رشد ميكنند اما برخي از گونه ها مانند سالمونلاتيفي و سالمونلا پاراتيفي A سيترات منفي هستند Aksoy, 2004)). اين باكتري اكسيداز منفي و كاتالاز مثبت بوده. از توليدات اين باكتري ليزين در كربوكسيلات، سولفات هيدروژن وارنيتين مي‌باشد.
( Alcamo , 1997 ; Connie & Manuselis, 2000) .
از ديگر ويژگيهاي بيوشيميايي اين است كه اكثر سالمونلاها عدم توليد اندول، عدم توليد آنزيم‌هاي اوره آز، ليپاز، دزاكسي ريبونوكلئاز، فنيل‌آلانين و تريپتوفان دآميناز، دكربوكسيلاسيون اسيدهاي آمينه ليزين، اورنيتين و آرژنين، واكنش مثبت در آزمايش متيل‌رد(MR) و واكنش منفي در آزمايش وژس ـ پروسكوئر (VP) مثبت مي‌باشد.( (Alcamo , 1997 ; Dolye & Beuchat , 2007.

4-1-2- مقاومت در برابر عوامل فيزيكي و شيميايي
اين باكتري روي محيط كشت ماهها زنده ميمانند. حرارت 60 درجه را 15 تا 20 دقيقه تحمل ميكنند، سالمونلاها مدت 13 ماه در لاشههاي آلوده نگهداري شده در يخچال، 120 روز درآب، 280 روز در خاك باغچه و مدت بسيار طولاني در شيرخشكهاي بدون چربي و موادغذايي داراي تخم مرغ زنده ميمانند. سالمونلاها نسبت به سرما مقاوم بوده و مدت3 ماه در برف و يخ زنده مانده واز اين طريق ميتوانند اپيدمي بهوجود آورند. كلرامنفيكل استرپتوميسين و بسياري از آنتي بيوتيك هاي وسيع الطيف بر آن موثرند پني سيلين بر آن كاملا بياثر است. سالمونلاها همچنين نسبت به املاح صفراوي مقاومند وبه همين دليل از اين مواد نيز علاوه بر رنگها در تهيه محيط‌هاي غني‌كننده استفاده مي‌كنند Aksoy, 2004)).

5-1-2- خواص كشت
اعضاي اين جنس هوازي بيهوازي اختياري ميباشند. مزوفيل بوده و رشد بهينهي آن در دماي 37درجه است.با اينحال برخي از سالمونلاهادر شرايط شديد زيست محيطي مانند درجه حرارت بالاي 54 درجه و سرماي 4-2 درجه را تحمل كنند. pH مناسب
براي رشد آن 5/7-5/ 6 مي باشد ولي pH حدود 9- 5/4 را مي تواند تحمل كند و اگر pH پائينتر از 4 برود باعث از بين رفتن ميكروارگانيسم ميشود. pH بيشتر از 9 صرفا از رشد آن جلوگيري ميكند. غلظت نمك 3/ 5 % بالاتر عاملي در جهت جلوگيري از رشد و تكثير باکتري است (Jay et al., 2005 ; Doyle.M, 2007).
اکثر سالمونلاها در روي آگار مغذي بعد از 24 ساعت پرگنه هايي به قطر 3-2 ميلي متر و به رنگ سفيد، خاکستري، مرطوب ،کروي، مسطح، برجسته و صاف ايجاد مي کنند. اندازه و درجه کدورت پرگنه ها به نوع سروتيپ بستگي دارد. سالمونلاها در محيط هاي مايع نظير آبگوشت مغذي و آب پپتونه رشد زيادي دارند Jay et al., 2005)).
انواع محيط‌هاي غني كننده مي‌توان به آبگوشت تتراتيونات آبگوشت سلنيت F، آبگوشت را پاپورت (حاوي كلريدمنيزيم و سبزمالاشيت) و آبگوشت سلنيت سيستين اشاره كرده معمولاً بعد از 24ـ18 ساعت از محيط‌هاي غني كننده روي محيط‌هاي انتخابي جامد كشت مي‌دهند. از محيط‌هاي انتخابي و تفريقي مي‌توان به محيط مك‌كانكي و محيط سالمونلا ـ شيگلا، محيط سبز درخشان، محيط آهن ليزين‌دار، محيط داكسي كلات سيترات يا محيط ليفسون(DCA)، محيط هكتوئن و محيط داكسي كلات ـ ليزين ـ گزيلور اشاره كرد. محيط بيسموت سولفات آگار، نيز به عنوان محيط انتخابي براي جداسازي سالمونلا مورد استفاده قرار مي‌گيرد چرا كه قدرت انتخابگري اين محيط بالاست. اين باكتري‌ها معمولاً كربوهيدرات را با توليد اسيد و گاز تخمير مي‌كنند.
. (D’ Aoust , 1991 ; D’ Aoust , 1998 ; Connie & Manuselis, 2000 ; Ferretti , 2001)

6-1-2 شرايط رشد سالمونلاها
سالمونلاها قادرند در محيط‌هاي ساده آزمايشگاهي رشد نمايند و از تركيبات ساده كربن‌دار به عنوان منبع كربن و انرژي و از تعداد زيادي از تركيبات ازت به عنوان منبع نيتروژن استفاده كنند (D’Aoust , 1998).
اكثر سالمونلاها پروتوتروف بوده و در ميحط حداقل نمك با يك منبع كربن مناسب و يا محيط حداقل آمونيوم ـ گلوكز توانايي رشد دارند .(Morse, 1988)اكثر سويه‌هاي سالمونلاتيفي جهت رشد احتياج به اسيد آمينه تريپتوفان دارند. رشد سالمونلاها در دامنه حرارتي 5 تا 47 درجه است ولي دماي اپتيمم 37 درجه است .(D’ Aoust , 1991)
بعضي از گونه‌هاي سالمونلا درجه حرارت‌هاي بالاتر از c ْ54 را نيز تحمل مي‌كنند و عده‌اي ديگر خواص سرما دوستي را بوسيله رشد كردن در c ْ4ـ2 از خود نشان دادند. دردرجه حرارت‌هاي پائين امكان رشد و بقاي سالمونلا بيشتر است. گزارش شده كه سالمونلاها نسبت به خشكي حساسند از اينرو انتشار آنها از طريق گرد و غبار و ذرات خشك كمتر از آب و مواد غذايي مرطوب است. بقاء سالمونلاها به طور نسبي به درجه حرارت محيط وابسته است .(Davis , 1996) به طوريكه

این نوشته در پایان نامه ها و مقالات ارسال شده است. افزودن پیوند یکتا به علاقه‌مندی‌ها.