پایان نامه با کلید واژه های باکتري، دقيقه، ميشود.، ريخته

ase (100U)
Cinnagen, Iran
PCR Buffer 10X
Cinnagen, Iran
dNTP mix (10 Mm)
Cinnagen, Iran
Primer
Sigma, USA
Glycerol
Merck, Germany
Nucleic Acid Extraction Kit
Vivantis, Malaysia
Shigella – salmonella agar

MgCl2
Merck, Germany
Salmonella typhi
اهدايي دکتر مجيد مقبلي
dH2O (DNase & RNase free)
Fermentas, Lithuania
Nutrient agar
Merck (Germany)
Urease
Merck (Germany)
Chloroform
Merck (Germany)
Phenol
Sina clon bioscience

باكتري هدف از طرف دكتر مجيد مقبلي اهدا شد و براي تائيد هويت باكتري براي رنگآميزي و تستهاي بيوشيمياي آماده شد.

3-3- رنگ آميزي گرم
ابتدا از کلني باکتري موردنظر ، روي لام گستره اي تهيه کرده و گستره را خشک و سپس فيکس کرديم . سپس روي آن رنگ کريستال ويوله ريخته و بعد از يک دقيقه رنگ را خالي کرده و لام شسته شد، بعد از آن روي گستره محلول لوگل ريخته و بعد از گذشت زمان يک دقيقه و تشکيل کمپلکس کريستال ويوله لوگل ، عمل رنگ بري با مخلوط الکل- استون انجام شد. در اين مرحله اگر باکتري گرم مثبت باشد کمپلکس کريستال ويوله لوگل را از دست نمي دهد و بنفش مي ماند ولي اگر گرم منفي باشد ، کمپلکس را از دست داده و بي رنگ مي شود . مرحله بعد معرف رنگي سافرانين را اضافه کرده و بعداز 30 تا 60 ثانيه رنگ را خالي کرده و گسترش با آب شسته شد.
باکتريهاي داراي مشخصه لازم، براي انجام تستهاي بيوشيميايي جهت شناسايي و افتراق در محيط نوترينت آگار جديد کشت داده شدند. تستهاي بيوشيميايي استفاده شده براي افتراق باکتري هدف در ذيل آمده است.
4-3- تستهاي بيوشيميايي
اين تست که از تعدادي از محيطهاي جامد و نيمه جامد و مايع تشکيل يافته است، فعل و انفعالات مختلفي که توسط باکتريها انجام ميشود را مشخص ميکند. جهت مشخص شدن جنس باکتري در خانواده انتروباکترياسه از تست IMVC بهطور معمول استفاده ميگردد، که عبارتند از :تست اندول70، متيل رد71، وژس پرسكوئر72 و سيمون سيترات73.
جداسازي باکتري هدف بر اساس جدول افتراقي سالمونلا تيفي و انتخاب اهم تستها با ترتيب اتخاذ شده جهت راندمان بالاي جداسازي، مطابق با جدول 1-3 انجام گرفت.

جدول 1-3 . مشخصات بيوشيميائي گونه هاي انتروباکترياسه

تستهاي بيوشيميايي استفاده شده براي افتراق باکتري هدف در ذيل آمده است.

1-4-3- تست سيمون سيترات
براي آزمايش سيترات از محيط کشت جامد سيمون سيترات (تهيه شده از شرکت مرك) استفاده شد. محيط سيترات حاوي سيترات سديم ( منبع کربن) و يونهاي آمونيوم( منبع نيتروژن) ميباشد. در اين آزمون، ابتدا توسط لوپ از کلني باکتري برداشته و در سطح شيبدار محيط سيمون سيترات کشت داده شد و به مدت 24 ساعت در حرارت 35 درجه سانتيگراد در گرمخانه نگهداري شد. با رشد اين باکتري، و واکنش هوازي معرف موجود در اين محيط (آبي بروموتيمول) از رنگ سبز به آبي تغيير مينمايد که نشانه وجود آنزيم سيتراتاز در باکتري است که توانسته سيترات را به اسيداستيک و اسيداگزاليک تبديل کند که در چرخه کربس مورد استفاده قرار خواهد گرفت.
2-4-3- تست تريپل شوگر ايرون آگار(TSI)
محيطي شيبدار با عمق 2 تا 5 سانتيمتر و قرمز رنگ ميباشد. معرف موجود در اين محيط فنل رد است. براي بررسي نحوه مصرف قندهاي گلوكز، لاكتوز، سوكرز و همچنين توليد گاز و توليد H2S توسط باكتري استفاده ميشود. زمانيکه pH محيط خنثي است رنگ محيط قرمز است و زمانيکه عمل تخمير صورت ميگيرد محيط اسيدي شده و محيط زرد رنگ ميگردد. از اين محيط براي بررسي تخمير قند گلوکز و لاکتوز استفاده ميکنند. روش کشت در اين تست شبيه سيمون سيترات است. يعني هم کشت عمقي و هم کشت سطحي همزمان صورت ميگيرد.
پس از کشت باکتري در اين محيط ممکن است 3 حالت پيش بيايد:
1. زرد- زرد: باکتري هم قادر به تخمير گلوکز و هم لاکتوز ميباشد مانند ويبريوكلرا.
2. قرمز-زرد: باکتري قادر به تخمير گلوکز و عدم تخمير لاکتوز است مانند سالمونلا و شيگلا.
3. قرمز-قرمز: عدم تخمير لاکتوز وگلوکز مانند بورخولدريا.
لازم است که محيط کشت بين 18 تا 24 ساعت در انکوباسيون قرار گيرد اگر نتايج آزمون زودتر از 12 ساعت مورد بررسي قرار گيرد نتيجه يا مثبت کاذب است يا تخمير هنوز به اندازه کافي انجام نگرفته است.
حجم ميکروبي که بر ميداريم نبايد زياد باشد زيرا اين باکتري ها پس از مصرف گلوکز شروع به استفاده از پپتون ميکنند و رنگ محيط مجددا قرمز ميشود.

3-4-3- تست SIM
تست SIM يكي ديگر از تستهاي تشخيصي از خانواده انتروباكترياسههاست. در اين تست سه فاكتور توليد SH2، اندول و حركت باكتري بررسي ميگردد. توليد SH2 به صورت رسوب سياه رنگ مشاهده ميشود. اندول مثبت با ريختن معرف كواكس بر روي كشت 24 ساعته در اين محيط با ايجاد رنگ ارغواني در معرف ريخته شده نتيجه گيري ميشود. اگر باكتري از نظر توليد اندول منفي بود ، بعد از ريختن معرف تغيير رنگي حاصل نميشود. آخرين فاكتور يعني حركت مثبت نيز با ايجاد كدورت يكنواخت در محيط كشت مشخص ميشود و اگر باكتري حركت منفي باشد ، رشد باكتري فقط در خط مستقيم كشت مشاهده ميشود و بقيه محيط شفاف باقي ميماند.
4-4-3- تست اوره
اين تست براي باکتريهايي که داراي آنزيم اورهاز هستند ميباشد. براي اين منظور ابتدا باکتري را در محيط اورهاز کشت ميدهيم. محيط اوره از ميتواند به صورت براث يا به صورت جامد باشد. اگر محيط به صورت براث بود بايد مقداري از کلني باکتريها را برداشته و در محيط مايع حل کنيم. اما اگر محيط اورهاز باکتري حاوي آگار بود بايد آنرا به صورت سطح شيبدار در لوله ي آزمايش ريخته و سپس باکت
ريها را در آن کشت داد. معرف موجود در اين محيط ترکيبي بهنام فنل رد ميباشد بههمين خاطر رنگ محيط زرد کم رنگ يا صورتي روشن است. اگر باکتري انزيم اورهآز داشته باشد ميتواند اورهي موجود در محيط را شکسته و در محيط کشت آمونياک توليد نمايد. آمونياک به علت قليايي کردن محيط باعث تغيير رنگ معرف به ارغواني يا صورتي ارغواني درآيد. بعضي باکتريها مانند پروتئوسها قادرند اين واکنش را با سرعت زيادي انجام دهند. اما برخي باکتريها مانند کلبسيلا و سيترو باکتر پس از 24 ساعت ميتوانند رنگ محيط را تغيير دهند. جهت استريليزاسيون اين محيط حتما بايد از فيلتر استفاده شود. زيرا اگر اتوکلاو صورت گيرد محيط خودبهخود قليايي شده و قبل از کشت باکتري رنگ محيط به طور خودبهخودي تغيير ميکند.

5-3- روش تهي? گلسيرول استوک از باکتري مورد نظر
از روي پليت LB آگار حاوي باکتري مورد نظر، يک کلني تک تازه (16 تا 24 ساعته) برداشته و به 5 ميليليتر محلولLB براث استريل تلقيح کرده و به مدت 3 الي 4 ساعت، با سرعت rpm 200در دماي 37 درجه روي شيکر انکوباتور گذاشته تا در طول موج 595 نانومتر به OD حدود 5/0 برسد. سپس 5 ميليليتر گليسرول 30 درصد (در LB براث) استريل را زير هود به اين لوله اضافه نموده، کاملاً هموژن کرده، در ميکروتيوبهاي 5/0 ميليليتر تقسيم کرده و سريعاً به فريزر منفي 20درجه انتقال ميدهيم.

6-3- روش استخراج DNA
استخراج DNA باکتري با روش دستي (استخراج با فنل- کلروفرم) طبق روشK?chl , 2005)) با كمي تغييرات انجام گرفت.
1-6-3- طرز تهي? محلولهاي مورد نياز براي استخراج DNA

جدول 2-3- محلول شماره I
EDTA
Tris base
Glucose
g 37/0
g 3/0
g 1
انحلال در آب مقطر، رساندن به حجم ml100 با آب مقطر. تنظيم 8pH =

جدول 3-3- محلول شماره II
SDS
NaOH
g 25/0
g 2/0

انحلال در ml20 آب مقطر با حرارت و رساندن به حجم نهايي ml 25 با آب مقطر. تنظيم6/12pH =
محلول شماره 1 در يخچال و محلول شماره 2 در دماي اتاق نگهداري ميشوند. محلول شماره 2 حداکثر به مدت دو هفته پايداري داشته و پس از آن بايد مجدداً بصورت تازه تهيه شود.

2-6-3- مراحل استخراج DNA
– يک کلني ازکشت تاز? باکتري به 5 ميليليتر محيط LB براث تلقيح شد و در انکوباتور شيکردار در دماي 37 درجه سانتيگراد به مدت يک شب گذاشته شد.
– 3 ميليليتر از محيط حاوي باکتري رشد يافته، به مدت 3 دقيقه در rpm 13000ميکروفيوژ شد.
– مايع رويي دور ريخته و رسوب تهيه شد.
– مقدار 200 ميكروليتر از محلول 1( pH 9/7 ، mM 2 Sodium EDTA ،mM 40 Tris_Acetate )
(Kado & Liu 1981) به رسوب حاصل اضافه و به خوبي مخلوط شد.
– به مقدار 2 برابرحجم محلول 1 ( 400 ميكروليتر) بافر ليزکننده يا محلول 2
(pH 6/12 ، SDS 1% ، NaoH 8/0%)، (Kado & Liu 1981) اضافه شده و در بنماري در دماي 65 درجه سانتيگراد جهت فعاليت بافر ليزکننده به مدت 10 الي 20 دقيقه گذاشته شد.
– مقدار 600 ميكروليتر فنل متعادل شده با تريس و 600 ميكروليتر کلروفرم به محلول اضافه کرده و بعد از 50 بار سر وته کردن کامل به مدت 5 دقيقه در rpm 13000فيوژ شد.
– فاز بالايي حاصل از ميکروفيوژ يا فاز آبي با دقت کشيده شده و به تيوب جديد انتقال يافت.
– به 2 برابر حجم حاصل از فاز آبي ، براي حذف باقيمانده فنل ، کلروفرم اضافه کرده و دوباره به مدت 5 دقيقه در rpm 13000فيوژ شد.
– بار ديگر فاز بالايي يا فاز آبي کشيده شد و به تيوب جديد منتقل شد.
– به مقدار 6/0 حجم فاز آبي موجود ، اتانول 99% اضافه کرده و بعد از چند بار سر و ته کردن به فريزر 20- درجه سانتيگراد منتقل شد
– بعد از نيم ساعت از فريزر در آورده و به مدت 10 دقيقه در rpm 13000 فيوژ شد.
– مايع رويي را دور ريخته و به رسوب حاصل 50 ميكروليتر بافر شستشو (اتانل 70 درجه) اضافه کرده و به مدت 3 دقيقه در rpm13000 فيوژ شد
– بافر شستشو را دور ريخته و رسوب در دماي اتاق چند دقيقه خشک شد.
– رسوب در 20 ميكروليتر آب مقطر حل شد
– مقدار 5/0 ميكروليتر آنزيم RNase به آن اضافه شد و در انکوباتور 37 درج? سانتيگراد به مدت 15 دقيقه گذاشته شد
– در نهايت، 5 ميكروليتر از DNA استخراج شده ، روي ژل آگارز 1% به مدت 40 دقيقه در 80 ولت الکتروفورز شد.

7-3- تعيين غلظت DNA با دستگاه اسپکتروفتومتر
براي تعيين غلظت محصول استخراج DNA، معمول است که از جذب در دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 260 نانومتر استفاده ميشود. دستگاه مورد استفاده ما، دستگاه Biowave, UK)) بود که به صورت ذيل براي آن عمل ميشود:
ابتدا وارد تنظيمات DNA دستگاه شده و ضريب رقت 50/1 را براي آن در نظر گرفته و ثبت ميکنيم. سپس در کووت دستگاه، 50 ميكروليتر آب مقطر ريخته و جذب آن را صفر ميکنيم. سپس کووت را خالي کرده و 50 ميكروليتر از محلول با رقت 50/1 محلول حاوي DNA را در آن ميريزيم. سپس جذب نمونه را بر عليه آب مقطر ميسنجيم. دستگاه مقادير زير را به ما ارائه ميدهد:
– غلظت نمونه بر حسب (ng/?l)
– جذب در 260 نانومتر
– جذب در 280 نانومتر
– جذب در 320 نانومتر
– نسبت جذب 280/260
– نسبت جذب 320/260
نسبت جذب 280/260 نشاندهندهي ميزان آلودگي با پروتئينهاست که بهترين محدودهي آن در نزديکي 8/1 است. نسبت جذب 320/260 نشاندهندهي ميزان آلودگي نمونه با پليساکاريدهاست که محدوده ان بايد بين 2 تا 5 باشد.
8-3- الکتروفورز
يکي از روشهاي بررسي کيفيت DNA (استخراج شده از بافت ها و يا محصولات PCR) استفاده از الکتروفورز ژل آگارز است. بهاين ترتيب ميتوان از سلامت DNA استخراجي و يا تخريب آن آگاه شد.
DNA به خاطر بارهاي منفي گروههاي فسفاتياش، زماني که در ژل آگارز ريخته ميشود تحت نيروي الکتريکي د
ستگاه قرار گرفته و با عبور از بين حفرات موجود در ژل از قطب منفي به سمت مثبت حرکت ميکند. هر چه طول قطعات کوتاهتر باشد، عبور از حفرات سريعتر صورت ميگيرد و مسافت بيشتري را در ژل طي ميکند. در مقابل قطعات بلندتر به سختي از حفرات عبور کرده و مسافت کمتري را طي ميکنند. الکتروفورز بر اساس روشهاي پيشنهادي Kolmodin (1997) انجام شد.
در صورت سالم بودن نمونههاي ژنومي، تک باندهاي واضح و روشني به موازات هر چاهک بايد تشکيل شود. اما در صورت تخريب ژنوم حين استخراج، DNA به صورت اسمير يا هالهاي روشن به موازات چاهک مربوطه ظاهر ميشود که نشان دهنده نامطلوب بودن استخراج است.
از مهمترين دلايل تشکيل چنين اسميرهايي، عدم دقت لازم حين استخراج و يا فشار مکانيکي روي نمونههاي DNA (ضربه هاي وارده با سمپلر به رسوب DNA و يا ورتکس شديد) ميتواند باشد.
براي حرکت DNA در ژل، از ولتاژ 90-80 ولت استفاده مي شود که به ازاي هر يک سانتيمتر از ژل، به آن ولتاژ 5 تا 10 ولت داده ميشود. غلظت ژل نيز بر اساس طول قطعات DNA در نظر گرفته ميشود. براي قطعات ژنومي معمولاً از غلظت 7/0 تا 1 درصد و براي محصولات PCR از 1 تا 2 درصد استفاده ميشود. براي مشاهده نمونههاي DNA بارگذاري شده در ژل از رنگ فلوئورسانس ايتيديوم برومايد استفاده ميشود که با قرار دادن ژل در دستگاه نمايشگر ژل به کمک نور UV ميتوان باند DNA را مشاهده کرد.

1-8-3- طرز تهيه ژل آگارز
براي الکتروفورز نمونههاي DNA، عموماً از ژل آگارز و بافر TBE استفاده ميشود. بافر TBE، براي ساختن ژل و سيال هادي جريان الکتروفورز استفاده ميگردد.

2-8-3- طرز تهي? بافر (1X)TBE

جدول 4-3- مواد بافر (1X)TBE
EDTA

Boric acid

Tris

g75 /0
g 97/2
g 9/10

مواد مذکور را در 800 ميليليترآب مقطر حل کرده و سپس با آب مقطر به حجم 1000 ميليليترميرسانيم.
لازم بهذکر است که ميتوان از بافر TBE (0.5X) نيز براي الکتروفورز استفاده کرد. به شرط آنکه ژل آگارز را نيز با همان غلظت از بافر TBE تهيه نمود که در اين پايان نامه نيز تمامي ژلهاي آگارز با TBE (0.5X) ساخته شد.
قبل از تهيه ژل آگارز، سيني مخصوص ژل را آماده کرده و شانه مخصوص در سيني قرار داده ميشود. فاصله شانه تا کف سيني معمولاً بايد 2 تا 3 ميليمتر باشد. سپس بسته به ظرفيت سيني ژل براي ايجاد چاهک مناسب ( مثلاً در اينجا 40ميليليتر) ، مقدار 4/0 گرم پودر آگارز را در 40 ميليليتر بافر TBE حل کرده تا ژل 1% فراهم شود. سپس روي شعله متوسط حرارت داده تا پودر آگارز حل شده و محلول کاملاً شفاف شود.
سپس کمي صبر کرده تا محلول کمي سرد شده(حدود 55 درجه) و سپس 1 ميكروليتر از رنگ اتيديوم برومايد (mg/ml10) به آن افزوده، 10 بار بصورت عدد 8 لاتين هم زده و در سيني ژل داراي شانه ريخته شد تا سرد شود. پس از اطمينان از بسته شدن کامل ژل، به آرامي شانه را از داخل آن درآورده و سيني حاوي ژل را داخل تانک

این نوشته در پایان نامه ها و مقالات ارسال شده است. افزودن پیوند یکتا به علاقه‌مندی‌ها.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *