منابع و ماخذ پایان نامه نقطه تقاطع

. فضا ساز پايين و شانه را به آرامي خارج گرديد. سپس داخل چاهکها چند بار با آب مقطر شسته شد و چاهکها با بافر تانک پر گرديد. قالب شيشه اي با گيره به سيستم الکتروفورز وصل گرديد و محفظه فوقاني و تحتاني سيستم الکتروفورز با بافر تانک پر شدند.
نکته: به منظور جلوگيري از تشکيل حباب در زير قالب شيشه اي و ممانعت ازضعيف شدن جريان الکتريکي در حين انجام الکتروفورز، بهتر است ابتدا محفظه تحتاني سيستم الکتروفورز را با بافر تانک پر کرده سپس قالب شيشه اي را به طور مايل وارد محفظه تحتاني کنيد و يا مي توان با استفاده از يک سرنگ پر شده با بافر تانک حبابهاي تشکيل شده در زير قالب شيشه اي را خارج کرد.
3-14-3-1 استخراج پروتئين از بافت برگ گياه تاج ريزي
براي استخراج پروتئين از يک نمونه گياهي انتخاب بافر مناسب اهميت ويژه اي دارد. بنابراين مجموعه اي از بافرها با ترکيب و pH معين مورد آزمايش قرار گرفت و در نهايت بافر تريس- ساکارز با pH=7.5 و بافر تريس- گليسين با pH=7.2 قابل استفاده تشخيص داده شدند که بافر تريس -ساکارز استفاده شد. در اين مرحله از بافت گياهان نگهداري شده در دماي 20- درجه سانتيگراد استفاده گرديد. جهت استخراج پروتئين محلول ابتدا 1 گرم از بافت گياهي توسط ترازوي دقيق توزين شد و سپس هر يک از نمونه ها توسط 5/2 ميلي ليتر بافر استخراج تريس- ساکارز (pH=7.5) در هاون چيني که در ظرف يخ قرار داشت ساييده شدند. سپس محلول حاصل از سايش نمونه ها با استفاده از سانتريفيوژ مدل R2028Napco به مدت 10 دقيقه در g 5000 و دماي صفر درجه سانتريفيوژ شد. و محلولهاي رويي پس از صاف شدن براي تزريق در ژل استفاده گرديد. البته مي توان آنها را در حجمهاي کم در لوله هاي اپندورف در دماي 20- درجه سانتيگراد نگهداري کرد. به هم حجم نمونه بافر نمونه اضافه کرده سپس مدت 5 دقيقه در آب جوش قرار گرفته شد. در اين حالت پروتئنها به علت وجود 2-مرکاپتو اتانل از محل پيوندهاي دي سولفيد باز شده زير واحدهاي آن از هم جدا گرديده و به SDS متصل مي شوند.
پس از سرد شدن نمونه را بمدت 5 دقيقه در 1200دور توسط سانتزيفيوژ (Sigma 1-13) ميکروفيوژ گرديد. اين عمل سبب حذف ذرات درشت و تجمع يافته گرديده و بازده الکتروفورز را افزايش مي دهد.
6- 40 ميکروليتر نمونه با استفاده از سمپلر در داخل چاهک ريخته شد. مقدار نمونه قرار داده شده در هر چاهک بستگي به اندازه چاهک ميزان خلوص نمونه روش رنگ آميزي و نوع بافر نمونه (6X, 5X. 2X) دارد.
7- سيستم الکتروفورز را به منبع تغذيه وصل گرديد. از ولتاژ(V ) ثابت استفاده شد. هنگاميکه نمونه در داخل ژل فوقاني بود ولتاژ V 100 و بعد از ورود نمونه به داخل ژل جدا کننده ولتاژ را به V 120 رسانده شد. اما چنانچه از شدت جريان (I) ثابت استفاده شود بهتر است در مرحله اي که نمونه در داخل ژل فوقاني قرار دارد از شدت جريان 15 تا20 و هنگاميکه نمونه به داخل ژل جداکننده (تحتاني) وارد شود شدت جريان به 20 تا 30 ميلي آمپر رسانده شود.
نکته: انتخاب مقدار شدت جريان يا ولتاژ بستگي به نوع سيستم الکتروفورز (ماکسي يا ميني ژل) و وجود يا عدم وجود سيستم خنک کننده دارد.
8- پس از اتمام الکتروفورز (رسيدن رنگ نشانه به انتهاي ژل) منبع تغذيه خاموش شد. قالب شيشه اي را خارج کرده سپس فضا سازها بيرون کشيده شد. با قرار دادن يکي از فضا سازها بين دو صفحه شيشه اي شيشه بالايي جدا شد. سپس ژل رنگ آميزي گرديد.(مي توان قبل از اينکه ژل را رنگ کرد قسمت فوقاني را جدا کرد و فقط ژل تحتاني را رنگ کرد. در اين شرايط معمولا گوشه پايين ژل جدا کننده را با بريدن علامت گذاري مي کنند).

3-14-3-2 تثبيت پروتئينها
پس از خاتمه الکتروفورز براي جلوگيري از حل شدن پروتئين ها در محلولهاي رنگ بر و کمرنگ شدن يا از بين رفتن احتمالي نوارهاي پروتئيني ضعيف ژل در محلول تثبيت کننده قرار داده شد. براي تهيه اين محلول 4/11 گرم تري کلرو استيک اسيد و 4/3 گرم اسيد سولفوساليسيليک و 30 ميلي ليتر متانول در مقداري آب حل شد و سپس حجم آن به 100 ميلي ليتر رسانده شد. ژلها به مدت يک ساعت در اين مخلول نگهداري شدند.

3-14-4 رنگ آميزي ژل پلي اکريلاميد
پس از تثبيت پروتئينها، به منظور ديدن باندهاي پروتئيني لازم است ژل رنگ آميزي شود. روشهاي مختلفي براي رنگ آميزي وجود دارد. اما براي رنگ آميزي ژل بيشتر از روش رنگ آميزي کوماسي بلو و رنگ نقره استفاده مي شود. در کارهاي تحقيقاتي معمولا از روش کوماسي بلو استفاده مي شود زيرا اين روش اگر چه دقت وحساسيت رنگ اميزي با نقره را ندارد اما يک روش سريع و ارزان بوده و ثبات اين رنگ طولاني مدت و نگهداري ژل رنگ شده راحتتر است.

3-14-4-1 رنگ آميزي با کوماسي بلو R 250
پس از خاتمه زمان تثبيت، ژل چندين بار با آب مقطر شستشو شده و به محلول رنگ منتقل شد.

3-14-4-2 مواد مورد نياز
اسيد استيک ، متانول و کوماسي بلو

3-14-4-3 محلولهاي مورد نياز
الف) محلول رنگ 25/0 گرم کوماسي بلو R250 را در 125 ميلي ليتر متانول حل کرده، سپس 25 ميلي ليتر اسيد استيک گلاسيال و 100 ميلي ليتر آب مقطر اضافه گرديد، پس از مخلوط شدن با کاغذ صافي واتمن شماره 1 صاف گرديد و در ظرف شيشه اي در چهار درجه نگهداري شد.
ژل به مدت يک شب (يا به مدت يک ساعت در دماي 40 درجه) در رنگ قرار گرفت از اين محلول مي توان چندين بار استفاده کرد.
ب) محلول رنگ بر
به 100 ميلي ليتر اسيد استيک 400 ميلي ليتر اسيد استيک و 500 ميلي ليتر آب مقطر اضافه شد، پس از مخلوط کردن در شيشه درب دار نگهداري گرديد.
در ابتدا محلول رنگبر در ف
واصل زماني کوتاه تعويض مي شد و به تدريج تعويض حدود 5-10 ساعت تا بي رنگ شدن کامل زمينه ژل صورت گرفت. سپس ژلها در محلول اسيد استيک 7 درصد نگهداري شدند.
3-14-5 تعيين وزن مولکولي با استفاده از الکتروفورز
از الکتروفورز براي تعيين وزن مولکولي زير واحدهاي يک پروتئين استفاده مي شود.
وقتي الکتروفورز در حضور دترجنت يوني SDS و در شرايط احيا (حضور 2-مرکاپتواتانول يا دي تيوترايتول) انجام مي گيرد، تحت اين شرايط عامل احيا کننده پيوندهاي گوگردي را شکسته و زير واحدهاي يک پروتئين از يکديگر جدا مي شوند و به ازاي طول زنجيره پلي پپتيدي به مقدار يکساني SDS متصل شده و پروتئين ها براساس وزن مولکولي در الکتروفورز از يکديگر جدا مي شوند، بين وزن مولکولي و حرکت نسبي87 پروتين (Rf) يک رابطه خطي وجود دارد.از همين خاصيت استفاده کرده وزن مولکولي يک پروتئين مجهول در حضور استاندارد وزن مولکولي تعيين مي کنند.

3-14-5-1 روش کار
1-استانداردهاي وزن مولکولي را همراه با نمونه پروتئيني مجهول در مجاورت يکديگر (دو چاهک جداگانه) و در شرايط يکسان الکتروفورز گرديدند.
2- پس از اتمام الکتروفورز و رنگ آميزي، حرکت نسبي (Rf) هر يک از باندهاي استاندارد وزن مولکولي و نمونه مجهول مطابق فرمول ذيل محاسبه گرديد.

مسافتي که هر باند پروتئين طي کرده

مسافتي که رنگ نشانه طي کرده
نکته: الکتروفورز را تا جايي که رنگ نشانه بروموفنل بلو به انتهاي ژل برسد انجام داده شد به گونه اي که رنگ نشانه از ژل خارج نشد.
3-بر روي کاغذ نيمه لگاريتمي در روي محور عمودي وزن مولکولي استاندارد و بر روي محور افقي، (Rf) هر يک از پروتئينهاي استاندارد را مشخص شد، نقطه تقاطع هر يک از وزن هاي مولکولي و (Rf) آنها مشخص و نقاط حاصل را به هم وصل شد.

3-14-5-2 رسم منحني استاندارد و تعيين وزن مولکولي پروتئينها
انتخاب نوع استاندارد بايستي با توجه به محدوده وزني پروتئينهاي مورد مطالعه و غلظت ژل پلي اکريل آميد(غلظت ثابت يا شيب غلظت) صورت گيرد.
در اين پژوهش جهت تعيين وزن مولکولي پروتئينها از استاندارد ساخت شرکت فرمانس(مخلوطي از پروتئينهاي با وزن مولکولي پايين، متوسط و بالا) استفاده گرديد.
3-15 تعيين ميزان يون کادميوم در اندام هوايي و ريشه به روش جذب اتمي88
به منظور اندازه گيري يونهاي فوق از روش جذب اتمي استفاده شد. روش جذب اتمي يکي از دقيقترين روشها جهت اندازه گيري ميزان عناصر مي باشد. اندازه گيري يونها در بافت ريشه و اندام هوايي انجام شد. براي اين منظور 5/0 گرم از بافت گياهي خشک را در 10 ميلي ليتر نيتريک اسيد غليظ به مدت 24 ساعت قرار داده تا نمونه گياهي به خوبي در اسيد حل شود. بعد از اين مدت محصول حاصل را گرم کرده تا بخارات اسيدي از محلول خارج شوند. سپس حجم محلول را به 50 ميلي ليتر رسانده و از کاغذ صافي عبور داده شدند.از محلول بدست آمده جهت اندازه گيري در دستگاه جذب اتمي Varian مدل Spectra aa 220 ساخت کشور استراليا استفاده شد.
ميزان تزريق نمونه در دستگاه 6 ميلي ليتر در دقيقه بود. جهت تعيين غلظت يون، محلول استاندارد يون را قبل از اندازه گيري نمونه به دستگاه تزريق کرده و نمودار استاندارد مربوطه توسط نرم افزار دستگاه (Spectra aa) رسم شده و غلظت مجهول محلول با استفاده از اين نرم افزار تعيين شد.
طبق منحني کاليبراسيون دستگاه، ماکزيمم جذب قابل قبول يک (Abs=1) مي باشد.

3-16 طرح آماري وآناليز دادهها
اين پژوهش به صورت در طرح بلوك كامل تصادفي با ، 6 سطح تيماري و 4 تكرار اجرا شد. ابتدا دادهها در محيط minitab ver 15 نرمال سازي و سپس تبديل داده لازم انجام شد و در آخر دادهها با کمک نرم افزار 9SAS ver آناليز شدند.

فصل چهارم

نتايج و بحث

4-2 نتايج حاصل از دادههاي بخش فيزيولوژي گياهي
4-2-1 طول اندام زميني
بر اساس مشاهدات زماني که تاج ريزي تحت تنش تيمارهاي کادميوم قرار ميگرفت کاهش نسبي در طول اندام زميني ديده شد و با توجه به اينکه کاهش طول ريشه درمواجه با تنشها در اکثر گياهان گزارش شده است کاهش مشاهده شده منطقي است اما باتوجه به جدول تجزيه واريانس(4-1) و نمودار (4-1)مي توان نتيجه گرفت که سطوح مختلف کادميوم بر طول ريشه اثر معني داري نداشتند و در4سطح 500 ، 250، 125
62.5، ميکرومولار با هم متفاوت نبودند وکاهش مشاهده شده در اثر خطاهاي محيطي بوده است اما دو سطح1000و شاهد تفاوت معني داري داشتند که ميتوان نتيجه گرفت که گياه تا يک سطح مشخص از کادميوم تحت تاثير قرار نميگيرد که اين نشان از تحمل بالاي اين گياه در مقابل تنش کادميوم مي باشد. محل اوليه تجمع كادميوم ريشه بوده و مقداري از آن به برگ منتقل مي شود.(سالت،1995 وهالت،1998)اين مورد از انجا که تاجريزي گياه بيش تجمع دهندهاي است کاملا با نتيجه بدست آمده مطابق است.

جدول (4-1) تجزيه واريانس طول اندام زميني
صفت
S.O.V
df
Ms
طول اندام زميني
تيمار
5
0.03171296 n.s

تکرار
3
0.11509259 n.s

نمودار (4-1)اثر کادميوم بر طول اندام زميني مقايسه ميانگينها (ميانگين چهار تكرار ) براساس آزمون LSD انجام شد
( ( p ? 0.05 ميانگينهايي كه حداقل يك حرف مشترك دارند از نظر آماري اختلاف معني داري ندارند.

4-2-2 طول اندام هوايي
در
مورد تاثيرکادميوم بر طول اندام هوايي همانطور كه در جدول تجزيه واريانس (4-2) و نمودار (4-2) مشخص است سطوح مختلف کادميوم بر طول ساقه اثر معني داري نداشتند و در6سطح (شاهد) 0 ، 500
،62.5،125،250،1000 ميلي مولار با هم متفاوت نبودند و موجب كاهش يا افزايش طول اندام هوايي بطور معنيداري نشدند (05/0 p، نمودار 4-2).اين در حالي است که در بسياري از تحقيقات، محققان کاهش رشد طولي ساقه در نتيجه کاربرد کادميوم را در لوبيا (بارجت، 2009)89، , و يونجه 2(ايدينالپ وهمکاران، 2009), گندم 3(وسلووت، 2003)گزارش کردهاند. ميهالسکو و همکاران 4(2010) بيان کردند که تجمع کادميوم باعث کاهش طول ريشه و ارتفاع در ذرت ميشود. بهعلاوه آنها استنباط کردند که اين کاهش به طور مستقيم متناسب با افزايش تجمع فلزات در گياه ميباشد. با بررسي اين نتايج ميتوان پي به اين نکته برد که تاجريزي با وجود تنش غلظت بالاي کادميوم توانسته به رشد طولي خود ادامه دهد ودر واقع اين شرايط تنش را تحمل کرده است.
جدول (4-2)تجزيه واريانس طول اندام هوايي
صفات
S.O.V
df
Ms
طول اندام هوايي
تيمار
5
0.6166667 n.s

تکرار
3
0.99804012 n.s

نمودار( 4-2) تاثير کادميوم بر طول اندام هوايي مقايسه ميانگينها (ميانگين چهار تكرار ) براساس آزمون LSD انجام شد( ( p ? 0.05ميانگينهايي كه حداقل يك حرف مشترك دارند از نظر آماري اختلاف معني داري ندارند.
4-2-3 كلروفيلa,b وکلروفيل کل
بررسي حاصل از اين تحقيق نشان داد كه كادميوم حتي در غلظت1000 ميليمولار،نيز اثر چنداني بر مقدار كلروفيل در مقايسه با شاهد ندارد. بطوريکه کادميوم مقدار كلروفيل كل را در تمامي 5 سطح 62.5 ،125 ،250 ،500، 1000ميليمولار كاهش يا افزايش معني داري نشان نداده است و اين در نمودارهاي(4-5) ديده ميشود . كلروفيل a وb نيز در تمامي سطوح تيمار نسبت به شاهد تفاوتي نشان دادند(نمودار 4-3 و 4-4). اين در حالي است که مقدار كلروفيل با افزايش غلظت كادميوم كاهش مييابد(هگوس و همکاران ،2001) 90 اين در حالي است كه در اين تحقيق مشخص شد مقداركلروفيل در گياهان تيمار شده با كادميوم نسبت به گياه شاهد كاهش قابل توجهي نشان نمي دهد. از طرفي فتوسنتزبه کادميوم حساس بوده و تثبيت کلروفيل و آنزيمهاي دخيل در Co2ازاهداف مهم کادميوم هستند.(شافعي و همکاران،2003 ؛لاوري و همکاران،1952) با توجه به عدم تغيير در رنگريزهها دليل قطعي بر بيش انباشته بودن تاج ريزي است.

جدول (4-3)تجزيه واريانس ميزان کلروفيل a
صفات
S.O.V
df
Ms
aميزان کلروفيل
تيمار
5
0.02920739 ns

تکرار
3
0.12675573 **

جدول (4-4)تجزيه واريانس ميزان کلروفيل b
صفات
S.O.V
df
Ms
bميزان کلروفيل
تيمار
5
0.00297270 n.s

تکرار
3
0.01685964 **

جدول (4-5)تجزيه واريانس ميزان کلروفيل کل
صفات
S.O.V
df
Ms
ميزان کلروفيل کل

تيمار
5
0.05071020 n.s

تکرار
3
0.23347377 **

نمودار( 4-3) تاثير کادميوم بر کلرفيل a مقايسه ميانگينها (ميانگين چهار تكرار ) براساس آزمون LSD انجام شد( ( p ? 0.05ميانگينهايي كه حداقل يك حرف مشترك دارند از نظر آماري اختلاف معني داري

پاسخی بگذارید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *